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冷冻电镜在分子生物物理学中的技术革命

1冷冻电镜技术的发展历程

结构生物学是通过解析生物大分子的三维结构等生物物理方法来研究其结构和功能的关系,进而理解生物大分子作用机制的一门学科。迄今为止,应用最广泛的结构生物学技术是X射线晶体学,但是该技术要求研究对象是能够结晶的蛋白质,不能结晶的蛋白解析难度较大,成为其发展过程中的瓶颈。另外,核磁共振波谱学技术不需要其研究对象形成晶体,而且能够达到原子分辨的水平,但是该方法仅适用于分子量较小的蛋白质、核糖核酸(RNA)或者它们的结构域。对于一些大型复合体、完整的膜蛋白、聚合物以及大分子组件,由于多种构象或者不同结构共存,这些“传统”方法的应用受到了限制。

单颗粒冷冻电镜技术是近几十年来发展比较迅速的一种生物物理和结构生物学方法,可以用来解析尺寸比较大的蛋白复合体以及细胞器的三维结构。该方法不需要蛋白质分子形成晶体结构并且仅需要相对较少量的生物样品,通过快速冷冻可以获得生物大分子的天然状态。近年来,硬件和软件的发展使得单颗粒冷冻电镜可以得到近原子分辨率的生物大分子结构,极大地提高了冷冻电镜的应用范围。另外图像采集以及数据处理的效率较之前都有了很大的提高,越来越多的高分辨大分子结构通过该技术被解析出来(图1)。

图1 近几年来电子显微镜数据库(Electron Microscopy Data Bank,http://emdatabank.org/) 中电镜三维结构密度图数量的增长

透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)可以观测到分子水平的生物样品。TEM图片代表所观测的样品在不同朝向上的投影,这些投影可以通过特定的算法对样品进行三维重建。早在1968 年,DeRosier 和Aaron Klug 利用傅里叶—贝叶斯原理将分子各个朝向的投影结合起来,得到了T4 噬菌体尾部的三维结构,标志着电镜三维重建技术的诞生。但是,由于生物样品本身所具有的特殊性,存在三个方法上的瓶颈,从而限制了冷冻电镜技术的发展:第一,生物样品中含水量较高,而透射电镜要求样品处于高真空的状态下;第二,高能量的电子会对样品造成损坏;第三,生物样品主要组成是碳、氢、氧等轻元素,对电子的反射及散射与水背景相比效果相近,获得的电镜图像衬度反差很小。因此,早期电镜三维重建技术的发展主要集中在解决这些基本问题上。

早期对于这些问题的解决方案主要是负染色技术,即将生物样品置于重金属盐负染液中染色,一些常用的负染液有钼酸铵、乙酸铀酰、甲酸铀酰、磷钨酸等电子密度高的物质,它们可以嵌入生物样品的间隙,根据其产生的对比进行电镜观察和三维重构。由于负染液是重金属盐,这不仅可以解决生物分子遭到辐射损坏的问题,同时可以提高图片的对比度。但是,样品经过负染以后会丢失很多高分辨的信息,在许多情况下分辨率只能达到15 Å左右,也就是说只能观察到生物分子的基本形状,一些细节信息没法获得。1974 年Ken Taylor 和Robert Glaeser 发现冷冻样品可以保持蛋白质的高分辨信息。这个工作标志着冷冻电镜应用于生物物理学领域的开始。随后,Dubochet 等人发展了一套切实可行的玻璃态样品的冷冻方法,加上当时人们对于低温技术已经掌握得比较成熟,使得冷冻电镜这个领域得到了广泛的应用和推广。

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