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一篇NC文章告诉你circRNA研究新思路

肽度时界
2017-01-14
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一般circRNA的研究思路主要是ceRNA,即circRNA可以结合miRNA,使miRNA的靶基因上调;或者ceRNA可以降低其来源mRNA的翻译水平。但是今天分享的这篇NC文章提供了新思路!circRNA可以结合蛋白,阻止蛋白行使功能,产生生物学效应。

摘要

环状RNA在真核细胞中是广泛表达的,但是其于人类疾病的关系还不清楚。这里我们发现环状RNA circANRIL(circular antisense non-coding RNA in the INK4 locus)可以通过抑制rRNA的成熟,促进细胞的凋亡,抑制增殖,激活p53通路,达到防止动脉粥样硬化的作用。circANRIL来源于和动脉粥样硬化相关的基因位点,可以与rRNA前体竞争结合PES1蛋白,从而是rRNA前体在细胞内聚集,细胞和压力增加,引起核仁的碎裂,p53的激活,细胞凋亡,不会在动脉中形成斑块。

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文章思路

发现circANRIL在不同程度的动脉粥样硬化的斑块内表达不同,与病重程度呈负相关。

circANRIL没有ceRNA的作用,也没有cis作用。过表达circANRIL,发现可以结合在circANRIL的三个miRNA没有变化,其来源的lncRNA也没有变化,其位点附近的mRNA同样没有变化。

过表达circANRIL可以抑制平滑肌细胞和单核巨噬细胞的增殖,促进凋亡。

由于circANRIL来源的lnc有结合蛋白的作用,所以作者用label-free检测了与circANRIL结合的蛋白谱。这个实验类似于chip-seq,作者先在circANRIL上加上BoxB的核酸序列,这个序列会与-N-peptide结合,然后再用抗体pull-down ,用label-free检测蛋白谱。富集分析发现circANRIL pull-down下来的蛋白主要在核糖体RNA的形成和RNA剪切上。然后作者重显著富积的蛋白中选择了几个与核糖体剪切相关的蛋白,做RIP验证,发现circANRIL可以显著结合PES1蛋白

circANRIL和rRNA虽然不属于同一个RNA家族,但是有多个同源序列,且软件预测circANRIL与PES1的结合区域正是位于同源序列内,且PES1的结合区域就是其行使剪切rRNA前体的功能区域。

验证过表达circANRIL,引起的rRNA前体的聚集和p53的激活,核仁的碎裂,细胞的凋亡;将PES1中与circANRIL结合的区域敲出,同样可以引起上述现象;但是在过表达circANRIL的细胞中补充PES1后可以抑制上述现象。

可借鉴之处

1. circRNA的过表达,在序列两端加上内含子的序列,有助于circRNA的形成。

2. circRNA的干扰,干扰circRNA的同时,也就干扰了其来源的基因;解决办法就是通过在干扰后的细胞中过表达circRNA,看性状是否消失。

3. 怎么预测circRNA是否可以与某个蛋白结合,其结合的区域是什么。文章中使用的是catRNPID的软件,有在线版的,使用方法见分割线以下的部分。

catRNPID在线软件的使用方法:

1. 打开网页http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group

如果打不开的话,就换用谷歌或火狐浏览器。会用到其中的两个工具:

2. 评估蛋白是否可以结合RNA,结合的区域是哪些

进入“catRAPID signature”,把蛋白序列粘贴入方框中,填写邮箱,点提交就可以了。蛋白的个数不能超过100个,总氨基酸不超过10万个。

蛋白序列的格式,像下面这样:

>Unigene0000024

QEEEGLTGSSPSVENGVSEVLANRCDFKPVGSSELEEDEGFSDWSLKLEQRKQRSSGAQE

AEA

>Unigene0000025

MNHLEVAQEVEVSDEPGNGQVNESVEADLEHFEVEEEQQQQYALPYSRQGRGDREGQPGH

EDEG

>Unigene0000034

IKEEARRMIRNAQQVVALVMDIFTDVDLFSDLLDVAARRVPVYILLDDLNKQHFLDMAAK

CRVNLNYAEFLRVRTVSGPTYFCRTGMSFKGQLMEKFMLVDCNVVLSGNYSFMWSFEKIH

RSIAHIFQGELVASFDEEFRILFAQSEPLIPSETALIKMDNPFVMAPYSGTRPFYQRKLH

MMFPRDDSSMNSLPAYAD

过一阵时间(每个蛋白3分钟算),会把结果发邮箱中,告诉你每个蛋白的得分(0.5分之下,认为不具备结合RNA的能力),可能的RNA结合区域(有的得分超过0.5,但是不一定可以预测到RNA结合区域),如下:

3. 预测蛋白与某RNA的结合情况

进入“catRAPID fragments”,输入蛋白序列和RNA序列(格式同上),填邮箱提交。

后面会受到邮箱,点开结果链接就可以看到结果了,得到如下图的热图和表格。热图是png格式的,但是我们可以根据下面的表格画成pdf格式的热图。

嗯的,今天的分享就到这里啦~

来源:基迪奥生物

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