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circRNA的高分文章到底做了些啥?

近年来,非编码RNA研究领域中百花齐放,精彩纷呈。circRNA作为该领域中的新宠自是当仁不让,从NCBI有关于circRNA发表文献来说,一直处于一个持续上升的趋势(下图1)。很多热情高涨的小伙伴们都欲对其一探究竟,却又苦于不知从何下手而着急万分,那么本文则帮助大家更快更好的在circRNA领域占得一席之地。

circRNA的筛选及验证

显然,到目前为止,circRNA研究领域仍是一个充满了潜力的大宝库。每一个研究领域、研究方向都有发现新的circRNA功能的可能性。因而首先要从你的研究方向入手,找到属于你的circRNA。一般通过高通量的检测手段(芯片或测序),即可筛选到成百上千个在某种特定条件下与疾病特异性表达相关的circRNA。同样,高通量筛选的circRNA验证也是必不可少。

然而,circRNA的RT-PCR验证有其特别之处。常规PCR引物只针对目的片段的上下游进行设计,而circRNA引物可分以下两种方式设计:1)外显子环化circRNA,需要特异性针对剪切位点处(backsplice junction site)来设计primer;2)内含子环化circRNA,可跨剪切位点设计,也可围绕内含子区域设计引物。另外,circRNA引物设计建议还需要满足扩增产物长度不超过100bp;且内参基因不能选用线性mRNA,可采用外参弥补。

qPCR线性RNA和环状RNA设计原理及扩增产物图

circRNA功能验证

通常只要是你所在研究领域还没有circRNA发表文章,那么鉴定到与疾病表达相关特异性的circRNA,并稍加以验证,1~3分的文章还是可以的。如果再想把文章档次往上提一提,发表3-5分的文章的话,则需要用体内体外实验去验证circRNA的功能。

circRNA表达的组织特异性验证

此时,可用原位杂交技术(Situ Hybridization)进行验证。设计杂交探针时要跨backsplice junction位点,而后可很清楚的看到circRNA在哪些组织中表达很高,作为组织特性判断的依据。

正向验证——circRNA过表达

目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对,称之为Alu结构。基于此,可用PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列,而后依据相应限制性内切酶位点进行酶切,连接至pEGFP-C1载体中。将连接载体转染相应细胞样本,定量PCR检测转染效率。最后用divergent primer验证circRNA过表达倍数。

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